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引言
γH2AX 是染色体组蛋白H2A家族的成员之一。在各种理化因素刺激下,细胞DNA双链发生断裂,ATM、ATR等磷脂酰肌醇3-激酶使H2AX上的第139位丝氨酸发生磷酸化修饰,形成磷酸化的γH2AX 。γH2AX作为一种生物标志物可以清楚地反映DNA损伤程度和修复情况, 被国内外广泛应用于细胞凋亡研究中, 是细胞损伤应激反应的研究热点之一。常见的γH2AX鉴定分析方法包括免疫发光法和质谱法,但因复杂预处理过程会假阳性。因此原位实时检测细胞核内γH2AX对于准确评估遗传毒性至关重要。SERS技术具备原位、无损、预处理简单、高灵敏度等优势,有望用于γH2AX原位分析。但是,SERS检测细胞核内物质仍面临巨大挑战。SERS增强效果与粗糙金属尺寸相关,颗粒直径越大,振荡频率和增强效果越好。进入细胞核内需要穿过核孔,其限制直径尺寸为10-30nm,粗糙金属颗粒尺寸小导致SERS增强效果弱。在现有技术中,主要通过修改核定位序列实现主动运输至细胞核来实现核内检测,该技术提高了进核效率,却因基质存在而产生背景干扰。
在本文中,南京师范大学王琛教授课题组构建了一种基于金纳米粒子(GNPs)的小型免疫传感器SERS探针,成功检测受限靶点γH2AX,评估药物遗传毒性。作者利用γH2AX作为限制靶点的特性,构建了一种基于小尺寸(15nm)金纳米探针的γH2AX免疫传感器,并用TAT核靶向肽对其进行了修饰,以确保高的核进入效率。一旦DNA损伤被诱导,γH2AX的局部过表达通过免疫识别进一步募集探针,从而可以原位组装热点,将增强拉曼信号用于遗传毒性检测。本研究提出了一种研究提出了一种新的SERS检测受限靶诱导的尺寸转换和热点形成的方法,用于分析核内遗传毒性标志物。该技术的优点在于简化了SERS探针的结构和操作过程,避免了对含有热点的系统的额外设计,从而减少了背景信号,从而为在单个活细胞水平上原位实时检测核内靶标提供了参考。
结果分析
作者利用γH2AX作为限制靶点的特性,构建了一种基于小尺寸(15nm)金纳米探针的γH2AX免疫传感器,探针以4-巯基苄腈(4-MBN)修饰的15nm GNPs为增强颗粒,PEG2000为稳定链,TAT为穿透肽,γH2AX单克隆抗体为探测识别物,建立为抗-γH2AX@GPMT的SERS传感器。
实验时通过TAT穿透肽的小颗粒和核靶向功能进入细胞核,将构建的SERS细胞传感器与药物一起孵育。若药物没有遗传毒性探针以分散状态分布,拉曼信号弱。相反,如果药物具有遗传毒性发生DNA损伤,产生γH2AX的局部表达,诱导探针进一步免疫识别和聚集,在原位构建增强热点,产生高强度拉曼信号实现遗传毒性鉴定。
图1 (A)抗-γH2AX@GPMT制备原理图;(B) GNPs的ζ电势图;(C)不同GNPs紫外-可见光谱图;(D)不同基质拉曼光谱图(1592cm-1和2230 cm-1是4-MBN特征峰);(E)抗-γH2AX@GPMT的TEM图像;(F) anti-γH2AX@GPMT的EDX图
图2 (A)抗-γH2AX@GPMT的检测策略.(B)TAT修饰不同尺寸SERS基底Au尺寸分布(C)15nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm−1处的暗场、明场和拉曼光谱图(D)30 nm抗-γH2AX@GPMT在2230 cm−1处的暗场、明场和拉曼光谱图(E)MMS孵育前后SERS强度差值。(F)抗-γH2AX@GPMT的MMS平均需求量
图3 (A)γH2AX靶点体外模拟方案略.(B) γH2AX尺寸与PH值关系(C)加入抗-γH2AX@GPMT.后实物图(D)不同PH值孵育环境下,抗-γH2AX@GPMT的拉曼光谱。(E) 抗-γH2AX@GPMT在2230cm-1拉曼强度与PH值关系。(F) 不同浓度的γH2AX肽孵育的抗-γH2AX@GPMT的拉曼光谱图(G)抗-γH2AX@GPMT在2230cm-1拉曼强度与γH2AX肽浓度关系
图4 抗-γH2AX@GPMT的靶诱导机制.(A)加入γH2AX肽前后抗-γH2AX@GPMT的TEM图像(B) 抗γ的生物TEM图像H2AX@GPMTγH2AX孵育前后。(C)抗-γH2AX@GPMT拉曼光谱(D)抗-γH2AX@GPMT的2230 cm−1拉曼光谱归一化强度
图5 SERS传感器优化和表征。(A)不同时间下细胞摄取抗-γH2AX@GPMT显微图像(B) 加入GNP和抗-γH2AX@GPMT后L02细胞活性(C)不同传感器的CYP450代谢酶活性。
图6(A)药物遗传毒性评价方案。(B) 在不同时间MMS孵育时间细胞暗场、明场和拉曼Mapping图(2230 cm−1峰位)。黄色实线区域为拉曼采集区。黄色虚线圆圈表示细胞核区域(C)在不同时间MMS孵育时间细胞暗场、明场和拉曼Mapping图(2230 cm−1峰位)。(D) 不同孵育时间下2230 cm−1的拉曼平均强度
结论
本研究以γH2AX为细胞核内定向靶点,突破了SERS探针进入细胞核效率和信号增强因子之间的局限性。构建了一种基于GNP探针的γH2AX免疫传感器来评估药物遗传毒性。该传感器具备TAT膜穿透性和核靶向功能,使小颗粒探针能够穿过核孔并成功进入细胞核。该探针进入细胞核内后,GTIs诱导DNA损伤和γH2AX局部过表达,导致原位构建增强热点并产生强拉曼信号,进一步增强了探针的免疫识别性能,解决了小探针增强性能差和大探针入核效率差的矛盾难题。本文所设计SERS探针可原位分析细胞核内遗传毒性,为药物遗传毒性筛选提供了一种新方法,也为细胞核内原位实时检测提供了实验灵感。
南京师范大学王琛教授课题组简介
王琛,南京师范大学化学与材料科学学院教授,博士生导师,国家**青年科学基金获得者(2020年),江苏省“青蓝工程”**青年骨干教师、中青年学术带头人,南京师范大学中青年领军人才;南京师范大学本科、硕士,2011年博士毕业于南京大学化学化工学院生命分析国家重点实验室,2012-2016南京大学从事物理学博士后,2016-2017年麻省理工学院(MIT,美国)访问学者。至今,在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等学术期刊发表研究论文60 余篇;参编英文图书 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley);主持多项国家自然科学基金、江苏省重点研发、江苏省自然科学基金等项目;担任Chinese Chemical Letters期刊编委,中国分析测试协会青年学术委员会委员,江苏省材料学会副秘书长。
文章信息
本文以“Confined Target-Triggered Hot Spots for In Situ SERS Analysis of Intranuclear Genotoxic Markers”为题发表在Analytical Chemistry上,中国药科大学韩凌飞为*一作者,南京师范大学王琛教授和中国药科大学柳文媛教授为通讯作者。
本研究采用的是Im体育官方版app下载RTS2 多功能激光共聚焦显微拉曼光谱仪,如需了解该产品,欢迎咨询。
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